摘要：波蘭弗羅茨瓦夫大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用鏈霉菌模型開展SMC對(duì)ParB動(dòng)態(tài)行為與功能調(diào)控的主題研究。

在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體分離是保證遺傳信息準(zhǔn)確傳遞的核心生物學(xué)過(guò)程。這一過(guò)程主要由ParABS系統(tǒng)介導(dǎo)，其中ParB蛋白作為關(guān)鍵組分，通過(guò)結(jié)合特異的parS位點(diǎn)形成大型核蛋白復(fù)合體（稱為segrosome），進(jìn)而招募結(jié)構(gòu)維持染色體（Structural Maintenance of Chromosomes, SMC）蛋白復(fù)合物來(lái)協(xié)調(diào)染色體的高級(jí)組織與分離。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ParB具有CTP酶活性，其通過(guò)CTP結(jié)合與水解循環(huán)調(diào)控自身與DNA的相互作用——CTP結(jié)合的ParB二聚體在parS位點(diǎn)成核后發(fā)生構(gòu)象變化形成閉合鉗結(jié)構(gòu)，并沿DNA滑動(dòng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)散，而CTP水解則促使ParB從DNA解離。然而，SMC復(fù)合體作為ParB的重要招募對(duì)象，是否以及如何反饋調(diào)節(jié)ParB復(fù)合體的動(dòng)態(tài)特性與功能，長(zhǎng)期以來(lái)仍不明確。

針對(duì)該問(wèn)題，弗羅茨瓦夫大學(xué)的Katarzyna Pawlikiewicz等研究人員以模式生物委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）為對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建ParB-HaloTag（ParB-HT）融合蛋白菌株，結(jié)合時(shí)間推移熒光顯微鏡、單分子追蹤（SMT）、熒光恢復(fù)后漂白（FRAP）及染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等多學(xué)科技術(shù)，系統(tǒng)探究了SMC存在與否對(duì)ParB動(dòng)態(tài)行為、DNA結(jié)合特性及酶活性的影響。該研究論文已于2025年發(fā)表在《Nature Communications》期刊。

 圖1 SMC調(diào)控鏈霉菌中分離復(fù)合體內(nèi)ParB的結(jié)合

研究主要依托以下關(guān)鍵技術(shù)方法：首先利用微生物遺傳學(xué)手段構(gòu)建了ParB-HT標(biāo)簽菌株及SMC敲除株（△smc），通過(guò)時(shí)間序列顯微成像分析孢子形成過(guò)程中ParB復(fù)合體的動(dòng)態(tài)變化；應(yīng)用單分子追蹤分析ParB蛋白的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)；采用ChIP-seq在全基因組范圍檢測(cè)ParB與DNA的結(jié)合模式；并通過(guò)體外CTP水解實(shí)驗(yàn)量化SMC對(duì)ParB酶活性的調(diào)控。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置野生型與突變體對(duì)照，樣本來(lái)源于同步培養(yǎng)的鏈霉菌液體培養(yǎng)物。

研究結(jié)果主要包括以下方面：

The dynamics of ParB complexes in sporogenic cells

通過(guò)時(shí)間序列成像觀察發(fā)現(xiàn)，在孢子形成細(xì)胞中，ParB-HT復(fù)合體在菌絲生長(zhǎng)停止后27±10分鐘（T1）開始呈現(xiàn)規(guī)則排列，隨后在80分鐘左右逐漸解離。該過(guò)程與細(xì)胞分裂蛋白FtsZ形成的Z環(huán)出現(xiàn)與消失時(shí)間高度同步，表明ParB復(fù)合體在孢子形成期中短暫存在，并于細(xì)胞分裂時(shí)發(fā)生解離。

Elimination of SMC promotes disassembly of ParB-HT complexes in sporogenic cells

在SMC缺失菌株（△smc）中，ParB復(fù)合體規(guī)則排列的出現(xiàn)時(shí)間略早于野生型（20±9分鐘），但其解離時(shí)間顯著提前（79±25分鐘 vs 野生型114±42分鐘），且存在時(shí)間變異性降低。此外，SMC缺失還導(dǎo)致隔膜形成延遲和孢子成型時(shí)間略微延長(zhǎng)。Western blotting排除了ParB蛋白水平變化的影響，表明SMC確實(shí)具有穩(wěn)定ParB復(fù)合體的作用。

Elimination of SMC lowers mobility of ParB molecules

單分子追蹤顯示，在孢子形成早期（17小時(shí)），SMC缺失并未改變ParB的移動(dòng)性；但在晚期（22小時(shí)），△smc菌株中ParB的平均擴(kuò)散系數(shù)顯著降低（0.045μm2/s vs 野生型0.106μm2/s），且固定分子比例升高（62% vs 41.5%）。在幼齡營(yíng)養(yǎng)菌絲中，SMC缺失同樣導(dǎo)致ParB移動(dòng)性下降和固定分子分布分散化，提示SMC缺失可能增強(qiáng)了ParB與非特異性DNA的結(jié)合。

The absence of SMC increases the turnover of ParB-HT in the apical complex FRAP實(shí)驗(yàn)表明，盡管SMC缺失菌株與野生型均呈現(xiàn)約60%的熒光恢復(fù)率，但前者恢復(fù)半衰期（tau）顯著縮短（135±72秒 vs 222±200秒），說(shuō)明SMC缺失環(huán)境下ParB復(fù)合體具有更快的周轉(zhuǎn)速率，與前述復(fù)合體穩(wěn)定性下降的結(jié)果一致。

SMC promotes ParB spreading at parS sites

ChIP-seq分析揭示，在野生型中ParB結(jié)合于16個(gè)已知parS位點(diǎn)及1個(gè)新位點(diǎn)，并在其上下游延伸2.5–3 kb，表現(xiàn)出典型的擴(kuò)散特征。而在△smc菌株中，ParB在parS位點(diǎn)的結(jié)合信號(hào)減弱至野生型的一半，擴(kuò)散現(xiàn)象幾乎消失，但全染色體范圍內(nèi)的非特異性結(jié)合反而增加。這表明SMC是ParB特異性結(jié)合parS并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)散的關(guān)鍵促進(jìn)因子。

SMC reduces ParB CTPase activity

體外酶活實(shí)驗(yàn)表明，在parS質(zhì)粒存在下，SMC的添加使ParB的CTP水解活性從65.1±2.9 μmol/μmol/h降至35.2±5.2 μmol/μmol/h。利用蛋白互作界面突變體ParBSMC-（TDR132-134→AAT及D164R）進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該突變體本身酶活性降低，且SMC對(duì)其活性的抑制作用顯著減弱，說(shuō)明SMC對(duì)ParB CTP酶活的抑制依賴于二者間的直接相互作用。

研究最終得出結(jié)論：SMC通過(guò)直接相互作用抑制ParB的CTP水解活性，從而穩(wěn)定其閉合鉗構(gòu)象，促進(jìn)ParB在parS位點(diǎn)的加載與沿DNA的擴(kuò)散，增強(qiáng)segrosome的穩(wěn)定性。這一正反饋調(diào)控機(jī)制對(duì)于孢子形成期染色體的高效分離具有關(guān)鍵作用。同時(shí)，該研究揭示了SMC-ParB互作在細(xì)菌染色體組織中的核心地位，為理解ParABS系統(tǒng)與SMC協(xié)同工作機(jī)制提供了重要理論依據(jù)。

[1] SMC modulates ParB engagement in segregation complexes in streptomyces